染料法qPCR预混液

产品货号：

SY0861

中文名称：

染料法qPCR预混液

英文名称：

2×Hiper Spec SYBR Green qPCR MasterMix

产品规格：

5mL

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有高灵敏度和高特异性的特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hiper Spec Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量(30～70%)基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本制品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

组分	规格
2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix	1mL×5
说明书	1份

保存：-20℃，避光，避免反复冻融，有效期1年。

注意事项

推荐使用本公司第一链cDNA合成预混液(去除gDNA)，以有效去除RNA样品中残留的基因组。
解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
本制品仅作科研用途。

配制SYBR qPCR反应体系：

成分	20μL反应体系	50μL反应体系	终浓度
2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix	10μL	25μL	1×
Forward Primer (10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
Reverse Primer (10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
模板DNA	X	Y	-
无菌超纯水	至20μL	至50μL	-

使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
模板稀释：cDNA原液建议5～10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20～30个循环为好。
反应体系：推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

设置SYBR qPCR反应程序：

➤标准程序：

➤快速程序：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	2min	1
变性	95℃	10sec	40
退火/延伸	60℃	30sec	40

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30sec	1
变性	95℃	3sec	40
退火/延伸	60℃	20sec	40

快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。
退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
20sec：Applied Biosystems 7700,7900HT,7500 Fast
31sec：Applied Biosystems 7300
32sec：Applied Biosystems 7500
熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
Ct值落在20～30之间时，定量分析最准确；
Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
Ct值介于30～35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
熔解曲线：
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，可以在100bp～300bp内选择。
正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃～65℃为佳。
引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

适用机型
ABI:5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus;7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio 6,7,12k Flex;
Stratagene:MX3000P,MX3005P,MX4000P;
Bio-Rad:CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;
Eppendorf:Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;
Qiagen:Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science:LightCycler 480,LightCycler 2.0;Lightcycler 96;
Thermo Scientific:PikoReal Cycler;
Cepheid:SmartCycler;Illumina:Eco qPCR.
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